dna印跡法(southern blot, sb)
sb已廣泛應用於分析dna和端粒結構. 用限制性核酸內切酶hin fⅰ或rsa ⅰ消化dna, 然後瓊脂糖電泳分離不同大小的片段, 轉移到硝酸纖維或尼龍膜上. 用32p同位素或生物素、鹼性磷酸酯酶標記的端粒特異探針與其雜交(cccatt)n.
末端限制酶切片段(trf)通過光密度計定量測量. 選用hin fⅰ或rsa ⅰ是因為這兩種酶能頻繁的切斷dna, 使亞端粒區域變得盡可能小. 用於sb分析的dna應該是沒有被打碎和純度較高的, 但是因為dna的高分子量、高黏度使得這點較難保證.
trf法得到的資料除代表所有染色體端粒的長度外, 還包括部分亞端粒區長度. 因此trf法不能提供端粒的實際長度.
雜交保護分析法(hybridization protection assay,hpa)
hpa需要製備基因組dna、細胞或組織溶胞產物同吖啶酯(ae)標記端粒的探針進行雜交, 檢測發光強度, 確定端粒在alu序列中比例. 研究表明, alu序列中比例為0.01的端粒大約與2 kb的trf法測量的端粒長度對應.
hpa不需要完整的或沒有修剪的dna, 但是, 推薦使用下限為10 ng修剪過的dna. 純化的細胞dna或至少含有1000個細胞的組織溶胞產物都能用於測量. 雖然hpa不包括亞端粒序列, 但是hpa法沒有給出詳細的細胞或染色體水平的端粒資訊,也不能直接測定端粒長度.
螢光原位雜交(fish)
fish直接將寡核苷酸探針標記在端粒序列上. 標準的fish包括製作**中期的染色體以及dna變性, 與異硫氰酸螢光素(fitc)或cy3標記的寡核苷酸探針雜交, 用dapi或pi復染, 最後用螢光顯微鏡檢測訊號. fish方法被廣泛地應用於特定基因的細胞遺傳學研究.
fish自身的特點使其適合於測定端粒長度, 如小的端粒探針可增加進入細胞的滲入度, 而且單鏈探針不需要退火.幾種改良的fish: 用fish方法進行的端粒定量被稱作q-fish[14-15](quantitative-fish).
lansdorpet al用核酸肽(pna)寡核苷酸探針(pnafish)代替寡核苷酸探針改良了q-fish法. 因為帶電的脫氧核醣酸鹽主鏈被肽鏈連線的不帶電n-(2-氨基乙基)-甘氨酸主鏈替代, pna探針的複式結構遠比dna/dna或dna/rna的穩定.結合fish和免疫染色(teli-fish)的方法可以測量用甲醛固定,石蠟包埋的人組織樣本的端粒,同時還可以鑑別細胞種類.
在teli-fish中只需用很少的細胞, 這種方法可以忽略不同細胞種類而直接比較正常和癌變細胞的端粒長度. perneret al發明了端粒/著絲粒-fish(t/c-fish)測量每個單獨的染色體臂的端粒長度的方法, 2號染色體著絲粒作內參. 螢光強度的比率經過計算同trf法有很好的相關性.
yan et al 在染色質/dna纖維製備中應用了fiber-fish法. 端粒的特異pna green探針和1q亞端粒的特異red探針在染色質纖維上同時雜交, 已知的1q亞端粒探針大小為100 kb. 因為解壓縮的染色質的可變伸縮性使得纖維雜交的時候顯色長度變得可變.
然而, 目的序列同亞端粒探針有相似的伸縮程度. 因此, 用已知大小的亞端粒探針作對照對判斷dna纖維解壓縮的程度起很重要的作用. 在檢測淋巴母細胞系1q時, 端粒和亞端粒排列在纖維上的訊號範圍分別在0.
9 μm-2.9 μm和13.8-29 μm之間.
這意味著根據纖維的不同伸展程度雜交到纖維上的探針可見長度為3.4-7.2kb/μm(平均5.
5 kb/μm) .
流式細胞計量-螢光原位雜交(flow-fish)
flow-fish包括6個基本步驟: 細胞分離, dna變性並與pna探針雜交, 洗去多餘探針, 復染後用流式細胞計量術採集和分析.來自不同細胞系和臨床樣本的骨髓、血液淋巴結、經過檢測的扁桃體的端粒長度值同trf法有很好的相關性.
同q-fish相反, flow-fish可以分析週期中和非週期中的細胞端粒, 整個操作只需1d. 此外, 不同的細胞亞群能夠同時處理, 這對於分析較難純化的細胞是很有用的. flow-fish法測定端粒長度在研究有核血細胞在正常個體和病態個體的血液病時有很高的實用性.
flow-fish同時分析端粒長度和細胞表型的技術難度很高, 因為只有很少的帶有合適發射光譜的螢光染料能承受dna變性和pna雜交的條件. baerlocher et al運用hydra 96孔微型分注器測量端粒長度, 他可以定量差異很小(0.5kb)的端粒片段, 而且只用很少的細胞(1000個).
當同時測量複雜樣品時, 這種自動化操作盡顯優勢.
寡核苷酸引物原位dna合成法(prins)
特殊長度的測量方法
在測量長度的過程中，經常會遇到一些不好直接測量的情況，如細銅絲的直徑 圓柱體的周長 硬幣的直徑 曲線的長度等等，同學們常用到以下幾種特殊的測量方法 一 累積法 由於測量工具精確度的限制，某些微小量，無法直接測量，在測量時，可以把若干個相同的微小量，集中起來，做為乙個整體進行測量，將測出的總量除以微小...
姿態測量方法
盾構機姿態測量例項 德國vmt公司製造的盾構機掘進姿態測量方法。1，德國vmt公司製造的盾構機。在盾構機主機橫向截面上有18個由螺母構成的測量標誌點，這些點在盾構機構建之時就已經定位，每個點相對於盾構機的軸線有一定的幾何關係，並在由盾構機軸線構成的座標系中有座標資料。盾構機軸線座標資料如下圖 2 測...
櫥櫃測量方法
怡海弘業家具設計現場測量方法 一 測量前的準備 1 思想認識上的準備 測量現場是我們工作的戰場。如果我們設計失誤，公司所有的工序都要因你的錯誤而付出無謂的勞動。我們的一次安裝成功率不太高的乙個很重要的原因就在於現場情況沒有把握準確。因此，要想成為乙個高水平的設計師，必須要在測量上很下工夫，要做到10...