微生物生理指標的測定方法
教學目的：1.了解微生物生理指標的測定方法的基本原理；
2.掌握測定的方法和意義。
教學重點：1.掌握重量法和體積測量法測定微生物生理指標的過程
2.會測定菌種細胞內的化學成分
教學過程：
測定微生物生長的相關生理指標，也可間接地反映出微生物的生長量，常用的方法如下：
1.稱乾重法：
可用離心或過濾法測定。一般乾重為濕重的10-20%。在離心法中，將一定體積待測培養液倒入離心管中，設定一定的離心時間和轉速，進行離心，並用清水離心洗滌1-5次，進行乾燥。
乾燥可用烘箱在105℃或100℃下烘乾，或採用紅外線烘乾，也可在80℃或40℃下真空乾燥，乾燥後稱重。如用過濾法，絲狀真菌可用濾紙過濾，細菌可用醋酸纖維膜等濾膜過濾，過濾後用少量水洗滌，在40℃下進行真空乾燥。稱乾重發法較為煩瑣，通常獲取的微生物產品為菌體時，常採用這種方法，如活性乾酵母（activity dry yeast, ady）,一些以微生物菌體為活性物質的飼料和肥料。
2.體積測量法：又稱測菌絲濃度法。
通過測定一定體積培養液中所含菌絲的量來反映微生物的生長狀況。方法是，取一定量的待測培養液（如10毫公升）放在有刻度的離心管中，設定一定的離心時間（如5分鐘）和轉速（如5000 rpm），離心後，倒出上清夜，測出上清夜體積為v，則菌絲濃度為（10-v）/10。菌絲濃度測定法是大規模工業發酵生產上微生物生長的乙個重要監測指標。
這種方法比較粗放，簡便，快速，但需要設定一致的處理條件，否則偏差很大，由於離心沉澱物中夾雜有一些固體營養物，結果會有一定偏差。
3.測定菌種細胞內化學成分
微生物的生長伴隨著一系列生理指標發生變化，例如酸鹼度，發酵液中的含氮量，含糖量，產氣量等，與生長量相平行的生理指標很多，它們可作為生長測定的相對值。
（1）測定含氮量：
大多數細菌的含氮量為乾重的12.5%，酵母為7.5%，黴菌為6.
0%。根據含氮量×6.25，即可測定粗蛋白的含量。
含氮量的測定方法有很多，如用硫酸，過氯酸，碘酸，磷酸等消化法和dumas測n2氣法。dumas測n2氣法是將樣品與cuo混合，在co2氣流中加熱後產生氮氣，收集在呼吸計中，用koh吸去co2後即可測出n2的量。
（2）測定含碳量：
將少量（乾重0.2-2.0 mg）生物材料混入1毫公升水或無機緩衝液中，用2毫公升2%的k2cr2o7溶液在100 0c下加熱30分鐘後冷卻。
加水稀釋至5毫公升，在580nm的波長下讀取吸光光度值，即可推算出生長量。需用試劑做空白對照，用標準樣品做標準曲線。
（3）還原糖測定法：
還原糖通常是指單醣或寡糖，可以被微生物直接利用，通過還原糖的測定可間接反映微生物的生長狀況，常用於大規模工業發酵生產上微生物生長的常規監測。方法是，離心發酵液，取上清液，加入斐林試劑，沸水浴煮沸3分鐘，取出加少許鹽酸酸化，加入na2s2o3臨近終點時加入澱粉溶液，繼續加na2s2o3至終點，查表讀出還原糖的含量。
氨基氮的測定：
方法是，離心發酵液，取上清液，加入甲基紅和鹽酸作指示劑，加入0.02n的naoh調色至顏色剛剛褪去，加入底物18%的中性甲醛，反應數刻，加入0.02n的使之變色，根據naoh的用量折算出氨基氮的含量。
根據培養液中氨基氮的含量，可間接反映微生物的生長狀況。
（4）其他生理物質的測定：
p，dna，rna，atp，nam（乙醯胞壁酸）等含量以及產酸，產氣，產co2（用標記葡萄糖做基質），耗氧，黏度，產熱等指標， 都可用於生長量的測定。也可以根據反應前後的基質濃度變化，最終產氣量，微生物活性三方面的測定反映微生物的生長。如我所在bmp-2的發酵生產上，隨時監測溶氧量的變化和酸鹼度的變化，判斷細菌的長勢。
（5）商業化快速微生物檢測法：
微生物的檢測，其發展方向是快速，準確，簡便，自動化，當前很多生物製品公司利用傳統微生物檢測原理，結合不同的檢測方法，設計了形式各異的微生物檢測儀器裝置，正逐步廣泛應用於醫學微生物檢測和科學研究領域。例如：
①抗干擾培養基和微生物數量快速檢測技術結合解決了傳統微生物檢測手段不能解決的難題，為建立一套完整的抗干擾微生物檢測系統奠定了堅實的基礎。中科院廣州分院合作產業處提供的抗干擾微生物培養基，新型生化鑑定管，微生物計數卡，環境質量檢測試劑盒等，可方便的用於多項檢測。
②bactometer 全自動各類總菌數及快速細菌檢測系統可以數小時內獲得監測結果，樣本顏色及光學特徵都不影響讀數，對酵母和黴菌檢測同樣高度敏感原理是利用電阻抗法（impedance technology）將待測樣本與培養基置於反應試劑盒內，底部有一對不鏽鋼電極，測定因微生物生長而產生阻抗改變。如微生物生長時可將培養基中的大分子營養物經代謝轉變為活躍小分子，電阻抗法可測試這種微弱變化，從而比傳統平板法更快速監測微生物的存在及數量。測定專案包括總生菌數，酵母菌，大腸桿菌群，黴菌，乳酸菌，嗜熱菌，革蘭氏陰性菌，金黃色葡萄球菌等。
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