crispr-derived genome editing technology
a pylcrispr/cas9-mt(ii) vector system for targeting mμltiple gene sites of dicot plants
華南農業大學劉耀光實驗室
1. crispr-cas9核酸酶切靶序列原理圖示：
2 相關載體圖譜
2.1 crispr—grna vector：
注：用載體骨架隔開u6啟動子和grna區，可以避免沒有被bsai切斷的空載分子被pcr擴增，見後面說明
2.2 crispr雙元載體 (雙子葉植物用，也可用於單子葉植物，但pylcrispr/cas9-mt(i)更合適單子葉植物)
3. 基因組靶位點選擇和雙鏈接頭設計
3.1 靶位點選擇
（1）在目標區如果能夠找到ngg上游第20鹼基是a（用u3啟動子）或g(用u6啟動子）的序列（ (u3或u6啟動子轉錄起始鹼基），優先選為靶序列
合成接頭的形式（u3啟動子右上，u6a啟動子右下） 注意：接頭的2個粘性末端不互補
(2) 如果在ngg上游第20鹼基不是a或g，可選20鹼基為靶序列（kabin xie and yinong yang， 2013， molecular plant)
合成接頭的形式（u6a啟動子）
為了提高突變效率，對乙個目的基因設計多個靶點。建議在orf 5』區和中部區域各設計1個靶點，使之任何1個靶點的突變都可以產生功能缺失，或2個靶點之間的序列被敲除。
幾個靶位點設計例：
左圖：切點在起始密碼附近或盡量在orf上游，或在特定的功能域 (可能引起密碼子缺失和移碼)
右圖：切點在外顯子末端或前端（可能引起移碼，或內含子識別位點缺失使內含子不被剪下）
特異性檢查：雖然對植物基因打靶的特異性不是重要的問題（萬一有負面作用的脫靶發生，與原受體親本雜交就可排除），但應該將候選靶序列+ngg（5』端加幾十鹼基）對目標基因組做blast，避免在靶序列3』端+ngg與其它功能基因有高相似性。但是打算用乙個靶序列敲除2個或以上的同源基因時，就選擇幾個目標基因完全相同的區域為靶位點。
3.2 靶位點接頭設計例
4. 多靶點pylcrispr/cas9-mt(ii)載體構建
4.1 grna表達盒構建示意圖（三靶點為例）
note: stick ends b1』 and bl are complementary to the b1 and bl』 ends in pylcrispr/cas9-mt (i)vector, respectively.
為了提高接頭連線效率，使用較高的接頭濃度（0.05-0.1 μm），這樣主要是產生線性連線，而環狀連線較少。
但2種方式在隨後的pcr中，都是通過上游片段正鏈和下游片段負鏈通過接頭序列配對延伸而產生完整的目標片段
4.2 grna表達盒擴增引物
for t1：
ugccg-b1』: ataaattggtctcagccgtggaatcggcagcaaagg-3 （u6啟動子上游引物）
grctga-b2: ataatttggtctcttcagccatccactccaagctc-3 (grna引物)
for t2:
uctga-b2』: ataaattggtctcactgatggaatcggcagcaaagg-3
graaga-b3: ataatttggtctcttcttccatccactccaagctc-3
for t3:
uaaga-b3』: ataaattggtctcaaagatggaatcggcagcaaagg-3
grgact-b4: ataatttggtctctagtcccatccactccaagctc-3
for t4:
ugact-b4』: ataaattggtctcagacttggaatcggcagcaaagg-3
grgttt-bl: ataatttggtctctaaacccatccactccaagctc-3
4.3 靶標grna表達盒排列
目前只有1個u6啟動子，該啟動子在雙元載體的多次重複排列可能在農桿菌發生重組變異。建議目前版本構建最多3-4個靶點。我們正在轉殖更多的擬南芥u3/u6啟動子，以方便做更多靶點的穩定載體.
引物使用方法
1個靶點：用引物對b1』/bl 擴增相應的pu-t1-grna
2個靶點：用引物對b1』/b2, b2』/bl 擴增相應的pu-t1-grna, pu-t2-grna;
3個靶點：用引物對b1』/b2, b2』/b3, b3』/bl 擴增相應的pu-t1-grna, pu-t2-grna, pu-t3-grna;
4個靶點：用引物對b1』/b2, b2』/b3, b3』/b4, b4』/bl 擴增相應的pu-t1-grna, pu-t2-grna, pu-t3-grna, pu-t4-grna
4.4 靶標grna表達盒與pylcrispr/cas9-mt(ii)的連線示意圖
5 多靶點載體構建詳細操作方法：
1. 接頭合成：為了避免雙鏈接頭含有不完全長度分子。
將接頭引物te溶解成100 μm母液，各取1μl加入到98μl 0.5x te混合稀釋到1 μm。約90℃ 30 s，移至室溫冷卻完成退火。
2. grna載體酶切：取pu3-grna和pu6a~c-grna質粒各~500 ng ，在20μl反應用~0.
25 μl （5 u)bsai （neb公司）酶切20 min（不要過度酶切，過度酶切可能產生平滑末端和質粒自連線，而未切斷質粒不影響後續反應），冷凍儲存公用。
3. grna表達盒連線反應：酶切過的pu6載體與所對應接頭連線反應：
1 μl 10x t4 buffer；
1 μl (~25 ng) pu3-grna（pu6a~c-grna）載體；
0.5-1.0 μl接頭（最終濃度0.1-05 μm)
約35-70 u t4 dna ligase (0.1-0.2 μl )
加 ddh2o至 10μl
室溫連線約10-20 min（延長連線時間不會明顯提高效率）
4. pcr擴增： 取1-2 μl連線產物為模板，25-50 μl pcr (所有靶點的反應合計約100 μl)
按第9頁選擇引物對(0.2 μm)
kod （或其它高保真酶）
95 ℃ 1 min
10 迴圈：95 ℃ 15s，58 ℃ 15s ，68 ℃ 15 s（過長時間會使未切斷的載體被擴增）
15-20 迴圈：95 ℃ 15s，68 ℃ 15 s
5μl電泳檢查
5. 把所有要連線的u3-靶點-gdna和 u6a~c-靶點-gdna pcr產物混合(最好直接加入0.5μl核酸酶（exoi, takara)消化單鏈引物），酚抽提-乙醇沉澱或pcr產物純化kit純化。
6. 所有產物在100μl反應用20 u bsai 37 ℃酶切30 min，75 ℃ 3 min（使切出的12 bp末端小片段變性，以減少連線競爭）。酚抽提乙醇沉澱或過柱純化。
（如果必要，取約100ng產物做連線，電泳檢查是否能連成多聚體）
7. 取約2-3 μg pylcrispr/cas9-mt(ii), 在50 μl （20u bsai）酶切30 min, 用低熔點膠電泳**酶切的質粒片段（去除ccdb片段）。用0.
5x te洗**膠30分鐘，65 ℃ 3 min熔解，在40 ℃加入agarase（1u/100μl)處理30分鐘後，分裝成每管50-80ng冷凍儲存公用（一管做一次連線，以避免多次凍融）。
8. 在切好分裝的pylcrispr/cas9-mt(ii) (約50-80ng）管中，加入相當於每種靶點pcr產物約10-15 ng(如2種，共20-30ng，3種共約40-50 ng， 4種共約60-70 ng, 更多種時適當增加；這樣載體與每種插入片段摩爾比=1: 5-8) ，在10 μl 連線反應（~70 u連線酶） 20度連線2-3h。
透析30 min-1 h後，電激轉化dh10b（電激電壓1500-1600v/μl）。注意：塗板培養的ccdb表達基中要加入iptg至0.
5 mm（laciq基因型菌種用1.0 mm)，誘導沒有切除ccdb的空載質粒轉化子的ccdb表達致死。
9. 陽性轉殖檢測 ： 用第乙個靶點接頭的反向引物（第6頁）和u6上游引物配對，用菌落pcr篩選陽性轉殖(產物長度約340bp) 。
提取質粒，取約5ng質粒為模板再用所有靶點接頭反向引物和u6上游引物配對進行pcr確認（pylcrispr/cas9-mt(ii)空載體為對照，確認空載體不能擴出相同長度產物）；並用asci切出串聯的u6-grna表達盒片段（pylcrispr/cas9-mt(ii)空載體為對照）(1個表達盒約420bp )。一般不需要測序檢測。如果要測序，用第9頁的擴增引物從陽性轉殖擴出表達盒片段（1個靶點），用u6上游引物測序。
當2個靶點或以上，就只能將擴增產物轉殖，再用靶點接頭反向引物和相應的u6上游引物進行pcr，選出相應靶點的轉殖進行測序。
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