生物製藥工藝學實驗報告——摸索雙水相萃取酵母蔗糖酶的條件
一、 實驗目的
了解雙水相萃取的原理；
掌握蔗糖酶比活力測定的原理和方法。
二、 實驗材料
試劑：0.1 mol/l 磷酸鈉緩衝液（ph7.4），1 mol/l naoh溶液，5% 蔗糖溶液，dns溶液，1 mg/ml葡萄糖標準溶液；
固體試劑：peg1500,peg6000,硫酸銨
儀器：低速離心機，可見分光光度計，水浴鍋。
三、 實驗原理
雙水相萃取：某些高聚物之間或高聚物與無機鹽之間在水中以適當的濃度溶解會形成互不相溶的兩水相系統。
相圖：兩水相的形成條件和定量關係，常用相圖來表示，它是一條雙結點線。
影響分配係數的主要因素：
1 聚合物的相對分子質量
在聚合物濃度不變的前提下，當聚合物相對分子質量降低時，其疏水性下降，親水性蛋白質易分配於富含該聚合物的相中。
②聚合物的濃度
當雙水相系統的總濃度增大時，兩相性質的差別增大，蛋白質趨向一側分配。
③鹽類的影響
鹽的濃度影響蛋白質疏水性。
蔗糖酶活力測定的原理
蔗糖酶可作用於β－1，2糖苷鍵，將蔗糖水解為d－葡萄糖和d－果糖。
葡萄糖和果糖具有還原性，在偏鹼性條件下，可與3，5－二硝基水楊酸共熱後生成棕紅色物質，在一定濃度範圍內，還原糖的量和反應液的顏色強度成正比關係；蔗糖酶的活力通過其水解產生的還原糖量來反映。
四、 實驗步驟
1、 研磨法破碎酵母細胞
稱6g 活性幹酵母粉於研缽中，用搗杵研磨，破碎酵母細胞（至粉末狀），再加入30ml0.1m 磷酸鈉緩衝液（ph7.4），繼續研磨（成勻漿狀）。
吸取4ml 酵母細胞勻漿液分配於2 個dorf管中，5000rpm離心20min，留取上清液（標記為「粗酶液」）。將剩餘勻漿液平均分為2份，每份約12ml。
單因素實驗
考察peg濃度對蔗糖酶分配的影響
條件：硫酸銨濃度為15%，peg6000
peg6000濃度為：16%，20%
2.雙水相萃取蔗糖酶（雙水相體系重量為40g）
先稱量乾淨燒杯的重量，去皮，再將乙份酵母細胞勻漿液倒入燒杯中，稱量勻漿液的重量；
在燒杯中，再加入相應質量的peg和硫酸銨，補充蒸餾水至40g；
攪拌使peg和硫酸銨溶解，並充分攪拌5min，5000rpm離心20min，加速兩相分開；
在離心管上標明 「萃取組（上）」和「萃取組（下）」。
測量上、下相的體積，暫存於燒杯中，並用保鮮膜蒙上放於冰箱中。
3. 蔗糖酶活力測定
酶解反應體系
dns法測定體系中還原糖的含量
4. 製作葡萄糖標準曲線
沸水浴5min，自來水冷卻，補充10ml蒸餾水，以0號管調零，測定各組的od540nm
5.蛋白質含量測定
6.製作蛋白質標準曲線
五、 實驗結果
①計算蔗糖酶的活力
酶解反應體系中還原糖的質量
(葡萄糖標準曲線 x=1.6204y+0.07)
（酶活力（u/ml）＝還原糖的質量（mg） ÷ 0.1（ml）×酶解反應體系的體積（ml）÷酶液的體積（ml））
2 計算蛋白質的質量
（蛋質標準曲線 x=1.55y+0.016）
3 計算比活力
比活力=酶活力（u/ml)÷蛋白質濃度（mg/ml）
4 計算純化倍數和**率
純化倍數=萃取相的比活力÷粗酶液的比活力
**率=萃取相的酶含量÷粗酶液的酶含量
酶含量=酶活力（u/ml）×酶液體積（ml）
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