蛋白質膠的製備

sds-page蛋白質樣品的製備

將收集的各樣品加入等體積的2×sds-page loading buffer，煮沸裂解5min，冰浴2min，12,000rpm離心10min，取上清-20℃儲存備用。

sds-page蛋白質電泳（參照分子轉殖實驗指南操作）(薩姆布魯克,2002)

1）按照電泳裝置的使用說明，裝好潔淨乾燥的玻璃板。

2）分離膠的製備

按下列成分配製10ml 12%分離膠：

各成分加入後迅速旋渦混勻，用微量移液器將其小心地注入準備好的玻璃板間隙中，並為積層膠留出足夠空間。輕輕在頂層加入一薄層水封頂，以防止空氣中的氧對凝膠聚合的抑制作用。凝膠聚合完成後，倒掉覆蓋的水層，用水清洗凝膠頂部數次，用濾紙吸幹凝膠頂端的水。

3）積層膠的製備

按下列成分配製2ml 5%的積層膠：

各成分加入後迅速旋渦混勻，用微量移液器將其灌注到分離膠上，灌滿後小心插入加樣梳，盡可能避免產生氣泡。

4）待積層膠凝固後，小心拔下梳子。

5）將凝膠固定於電泳裝置上，加入足量的1×tris-甘氨酸電泳緩衝液，在加樣孔中分別加入20μl各樣品。

6）樣品在積層膠中電泳時，使用80v電壓，待溴酚藍帶進入分離膠後，將電壓公升至120v，繼續電泳直至溴酚藍帶到達分離膠的底部且開始泳出膠底面，關閉電源。

7）卸下凝膠，將其浸泡在至少5倍體積的考馬斯亮藍r-250染色液中，置水平搖床上室溫染色至少4h，之後取出染色的凝膠並**染液，以備再用，將凝膠浸泡於考馬斯亮藍脫色液中，在水平搖床上脫色4~8h，其間更換脫色液3~4次，直至凝膠脫色到條帶清晰為止，觀察記錄結果並拍照。

2×sds-page loading buffer

tris-hcl ph8.0 (25℃) 20mm

dtt100mm

sds2%

glycerol20%

bromophenol blue 0.016%

30%丙烯醯胺混合液

1.5m tris(ph8.8)

1.0m tris(ph6.8)

10%sds

temed