實驗方案
酵母菌酒精發酵的條件研究
學院（部）： 生物與化學工程學院
專業生物工程
學生姓名鑫
學號11018150
班級： 生物工程二班
指導教師肖
一、 實驗目的
1、學會實驗的設計和操作過程
2、找到酵母菌發酵時的最優條件
二、 培養基和實驗方法及材料的確定
1、 玉公尺粉的糖化方法
玉公尺粉的糖化採用雙酶法，其工藝流程如下
玉公尺粉→加水→液化→糖化→發酵→蒸餾→成品酒精
試驗中，發酵培養按照三角瓶100ml培養。本次工做20組是要，共需發酵液20*100=2000ml。培養液按照100g玉公尺粉、300ml水。所以共需玉公尺粉700g。
液化：取１００ｇ玉公尺粉，加入３００ｍｌ的水，液化溫度為９０℃，ｐｈ值為５．５，液化時間為３．５ｈ，液化酶的新增量為
ｇ玉公尺粉
糖化：糖化時的工藝條件為：糖化溫度為５８℃，ｐｈ值為４．５，糖化時間為３．５ｈ，糖化酶的新增量為０．３ｇ／１００ｇ玉公尺粉。
2、 活化培養基
本實驗在進行實驗時採用察氏(czapck)培養基的配製，配方如下表一：
表一3、 擴大培養基
擴大培養仍然用察氏(czapck)培養基，由於要用液體的，所以將其中的瓊脂配料去掉。
4、 發酵培養基
糖化液稀釋至l0%濃度，新增輔料（硫酸銨0.4%），ph5.5滅菌
三、 培養基的製備及酵母的活化
1、準備酵母母菌一支常溫下存放一天，增加菌種的活力。在母菌存放期間製作各時期培養基
2、準備固體培養基（察氏培養基）50ml，做成8支試管斜面，擴大培養基800ml（做擴大培養時使用）。做成8個三角瓶，每瓶200ml。120℃滅菌30min。
3、發酵液的製備
（1）玉公尺粉的篩選
實驗前準備粉碎後的玉公尺粉700g。
（2）玉公尺粉的液化
按照100g玉公尺粉、300ml水的配比對玉公尺粉進行液化，液化方案上文已經交代。在1000ml燒杯裡，或者500ml燒杯分兩次，水浴液化。
器材：燒杯500ml兩個，玻璃棒乙個，水浴鍋乙個，糖化酶0.225g
步驟：1、將糖化酶，玉公尺粉，水按照比例配置好在燒杯裡。2、將配好的玉公尺液放於水浴鍋中90℃液化3.5h。邊液化邊攪拌。
（3）玉公尺粉的糖化
將液化後的玉公尺液中按照0.3g/100ml加入液化液中。再在水浴鍋中，58℃糖化3.5h。
（4）過濾
糖化後的糖化液有可能有沒有徹底液化的玉公尺顆粒，會造成渾濁，這時需要對糖化液進行過濾操作。
操作步驟：
最後與以上培養基一起進行滅菌處理。滅菌時，清洗16支移液管，與培養基一起滅菌。
（5）活化步驟
器材：酒精燈，接種針，母菌，斜面培養基，消毒酒精。
步驟：1、將器材放於實驗台上。對雙手合桌面進行滅菌。
對接種針進行灼燒滅菌。2、在酒精燈旁按照無菌操作步驟在酒精燈火焰旁取下試管棉塞。3、將灼燒後的接種針伸入母菌試管取粘取少量母菌，粘取前將接種針放於試管內壁，冷卻5~6s。
4、按照無菌操作將取過母鐘的接種針移入活化試管內並畫曲線。5在酒精燈火焰旁將試管棉塞塞上，塞前將棉塞燒一下。如此接種八支試管。
並儲存28℃培養2d。
四、 酵母的擴大培養
器材：液體培養基，活化後菌種，酒精燈，接種針，消毒酒精。
步驟：1、將器材放於試驗台上，並對雙手和桌面滅菌，接種針進行灼燒滅菌。2、在酒精燈旁取下棉塞，並用接種針接種少量菌種於液體培養基內。
3、在酒精燈旁塞好棉塞，並於28℃培養。根據發酵單因素的不同，確定培養時間。其中變數是菌齡的一瓶瓶號1、2要求培養時間分別為：
對數期1：15~16h，對數期2:16~18h，緩衝期：
20~24h，穩定期：24~26h。其他菌種培養20h進行接種。
五、發酵培養
1、 不同菌齡下的發酵
器材：擴大菌種的四個不同階段即對數期1：15~16h，對數期2:16~18h，緩衝期：20~24h，穩定期：24~26h。移液管四個，酒精燈，發酵液，洗耳球。
步驟：1、將對數期1的菌種和其他裝置放於實驗台上。2、用移液管按照發酵液的10%的比例移取擴大培養液到發酵液中。
3、塞好棉塞將發酵液放於30℃條件下培養2d。4、按照以上步驟將不同菌齡的擴大菌種移接到發酵液中進行發酵培養。之後進行酒精檢測。
2、 不同菌量下的發酵
器材：擴大菌種，移液管四個，酒精燈，發酵液，洗耳球。
步驟：1、將實驗器材放於實驗台上。2、用移液管移取8%的擴大菌種到發酵液中。
3、塞好棉塞，將發酵液存放於30℃條件下發酵2d。4、按照以上步驟，分別移取10%、12%、14%的擴大菌種到發酵液中，30℃培養2d，之後進行酒精檢測。
3、 不同醪液濃度下的發酵
器材：擴大菌種，移液管四個，酒精燈，發酵液，洗耳球。
步驟：1、將實驗器材放於實驗台上。2、用移液管移取10%的擴大菌種到4個發酵液中。
3、製作不同濃度的醪液，分別按照1:2,1:3,,1:
4，1:5。3、塞好棉塞，將四個發酵液三角瓶編號1、2、3、4。
將發酵液按照序號存放於30℃條件下發酵2d。4、對發酵後的發酵液進行酒精檢測。
4、 不同發酵時間下的發酵
器材：擴大菌種，移液管四個，酒精燈，發酵液，洗耳球。
步驟：1、將實驗器材放於實驗台上。2、用移液管移取10%的擴大菌種到4個發酵液中。
3、塞好棉塞，將發酵液將四個發酵液三角瓶編號1、2、3、4。存放於30℃條件下發酵。按照序號分別培養2d、2.
5d、3d、3.5d。4、對發酵後的發酵液進行酒精檢測。
6、酒精檢測
器材：蒸餾裝置一套，200ml量筒4個，酒精檢測器乙個，
步驟：1、將100ml發酵液配製成200ml溶液於蒸餾燒瓶中。2、對200ml發酵液進行蒸餾，蒸餾出100ml酒精溶液。
3、取一定量的蒸餾出的酒精溶液於試管中放於酒精檢測器中進行酒精檢測並記錄資料，以上的四種發酵方法，均使用這種檢測方法。資料記錄於下表二中：表二
注：發酵溫度：t 發酵時間：d 接種量：s 菌齡：h
進行發酵培養是，除變數以外，其他條件按照，t=30℃、s=10%、h=20~24h、d=2d
七、最優條件的培養及最優條件確定
1、 以上四種最優條件共同作用下的發酵
器材：擴大培養液20~24h菌齡，發酵液，移液管，洗耳球
步驟：1、將實驗器材放於實驗台上。2、用移液管移取8%的擴大菌種到發酵液中。3、塞好棉塞，將發酵液存放於30℃條件下發酵2d。之後進行酒精檢測，檢測方法與六中相同。
2、 最優條件的確定、
八、實驗程序及任務按拍
6/9：進入實驗室進行儀器交接，同時取出母菌，進行活化前的預處理。
6/10：上午準備實驗儀器和實驗所用的藥品進行滅菌處理和玉公尺粉的液化和糖化等，下午進行活化的接種。後進行母菌的恆溫培養2d。
6/11：觀察酵母菌的生長情況。
6/12：下午進行接種擴大培養，將母菌接種到用於菌齡不同的發酵培養液中。
6/13：上午進行發酵培養用於菌齡不同發酵的接種，按照時間安排進行接種。下午進行接種用於不同培養時間發酵的擴大培養的接種。
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