檢測晚期凋亡。
基本原理： 對不同組織切片先增加細胞膜通透性，然後讓rtdt和bio標記的dtutp進入細胞內，在rtdt的輔助下dtutp與核斷裂的dna 3』-oh結合，再用hrp標記的鏈黴親和素與dtutp上biotin結合（每個鏈黴親和素至少可以再結合3個biotin分子），最後用dab、過氧化氫與sp上的辣根過氧化物酶hrp發生氧化、環化反應，形成苯乙肼聚合物而呈現棕褐色，最終通過計數每張切片上不同視野中tunel陽性細胞的比例來判斷細胞凋亡發生情況。
羅氏試劑盒
一、 試劑1、酶濃縮溶液5×50μl——末端脫氧核糖核酸轉移酶 （10×）試劑
2、標記溶液5×550μl——含有核苷酸混合液的反應液 （1×）試劑
3、轉化劑-pod 3.5ml——酶標記抗螢光素抗體（即用型，融後4℃儲存）
二、所需的溶液和儀器
10mm tris/hcl（ph7.4~7.8）、pk配製、dab、飯盒、吹風機、3%h2o2甲醇溶液、pbs、蓋玻片、中性樹膠、蘇木素、二甲苯和無水乙醇（用量多）、雙蒸水（用以配梯度酒精）
1, 充分脫蠟和水化。脫蠟可以先60度20min，石蠟切片於染色缸中，二甲苯浸洗2次共5min,100%、95%、90%、80%、70%乙醇浸洗3min×5；
②3%過氧化氫甲醇中浸洗10-15min，抑制內源性過氧化氫酶。
③用蛋白酶k（20μg/ml溶於tris/hcl中，ph7.4~8.0）室溫孵育15~30分鐘。
④pbs洗約5min*2次，擦乾樣品周圍的水。此階段配製tunel反應混合物——從試劑2中取出100μl標記溶液作為兩個陰性對照；將試劑1中取5μl+試劑2中45μl標記液中，配成50μl tunel反應混合物混勻（即配即用，4℃避光！）
⑤標記反應：滴加50μl的tunel反應混合液，在溼盒中37℃孵育60分鐘（為防蒸發和保證tunel 反應混合物均勻分布，可以在孵育過程中加蓋蓋玻片）。pbs洗5min*3次，至此樣品可在螢光鏡下（綠色）分析結果。
⑥訊號轉化和分析：擦乾樣品周圍的水分，加入50ul轉化劑-pod，溼盒中37℃孵育20~30分鐘（可以在孵育過程中加蓋蓋玻片）。pbs洗5min*3~5次
⑦加入50~100μl dab底物溶液，室溫（10~25℃）孵育5~10 min，pbs洗5min*3次。（蘇木素染1-3秒，以免視野全染，需要摸索條件）
⑧中性樹膠或者甘油封片（在封片前可以復染），光鏡下分析結果。穩定性：tunel反應混合物需在使用前立即製備，不能儲存，配好的此液體必須將放入冰浴中。
2、轉化劑-pod （即用型）：一旦融化此液體，需在4℃儲存（最多儲存6個月），並且不能反覆凍存。
蛋白酶k一般工作液濃度為20ug/ml,但濃縮液可配製1~10mg/ml，可用pbs配製，也可用蛋白酶k緩衝液（100mm tris hcl ph8.0+50mm edta）；
注意：1)蛋白酶k可以幫助滲透組織，但延長孵育時間可能導致切片脫落（come off the slide）,所以要最優化孵育時間長短。時間一般為10~30 min，4um左右的**可以用10 min，但30 um左右的可用30 min，最終通過摸索最佳時間。
過長易脫片、過短起不到通透效果。
2)對於比較困難的組織，可以選用0.1m ph6.0的枸櫞酸鹽緩衝液進行修復（石蠟切片無必要用），200ml需350w修復5min
3)對照： 陰性對照： 經過固定和通透的細胞樣品加入50μl試劑2以代替tunel反應混合物，從標記步驟以下同上。
陽性對照： 經過固定和通透的細胞樣品用細球菌的核酸酶或dnase i使之產生dna鏈缺口，從標記步驟以下同上。
4)操作流程：常規脫蠟、脫水處理——沖洗樣品——滴加tunel反應混合物，37℃孵育60分鐘——沖洗樣品——選擇：螢光鏡下觀察分析——滴加轉化劑-pod，37℃孵育30分鐘——洗樣品——滴加dab底物溶液，室溫孵育5-20分鐘——光鏡下分析結果
5)假陽性多的原因有很多：pod封閉不全、dab顯色時間過長等原因假陽性嚴重，可能原因應該是dab孵育時間過長，建議首先排除之，同時加強pbs浸洗
6)dab顯色時間:
（1）dab顯色時間不是固定的，主要由顯微鏡下控制顯色時間，到出現淺棕色本底時即可沖洗；
（2）dab顯色時間很短（如幾秒或幾十秒）就出現很深的棕褐色，這很可能說明你的抗體濃度過高或抗體孵育時間過長，需要下調抗體濃度或縮短你的抗體孵育時間；
（3）此外，若很短時間就出現背景很深，還有可能你前面的封閉非特異性蛋白不全，需要延長封閉時間；
（4）dab顯色時間很長（如超過十幾分鐘）才出現陽性染色，一方面可能說明你的抗體濃度過低或孵育時間過短（最好一抗4度過夜）；另一方面就是封閉時間過長。
7)脫片產生的原因和如何防止脫片:
（1）多聚賴氨酸玻片質量的問題。我原先是買的，邁新按說也是不錯的，可是都脫成什麼樣子了。後面補做第二批時用的病理科老師自己做的**，要好一點。
（2）組織切的不好，切片機的問題例如比較老的舊的機器切的厚或者不均勻，或者切片者手法不好等。
（3）組織的問題，越是有壞死之類越容易脫。
（4）沒烤好，時間短溫度不夠之類。
（5）操作的時候甩的太猛了，有脫片嫌疑的**最好不甩或輕輕甩，用衛生紙從邊緣上慢慢吸水。
（6）此外，一旦見到有組織漂起來操作就更加要謹慎，用pbs的時候盡量用泡的，不要衝。
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